Femåringen skal ha lekt med en rifle da et skudd skal ha gått av og lillesøsteren på to år ble truffet.
Toåringen ble brakt til sykehus, men døde senere av skadene, skriver nyhetsbyrået AP.
Den tragiske hendelsen skjedde i Cumberland County i den amerikanske delstaten Kentucky tirsdag.
Femåringen skal ha fått riflen i gave i fjor. Ifølge politiet ble riflen oppbevart i et hjørne hjemme, og foreldrene skal ikke ha vært klar over at den fortsatt var ladd.
Les også: Følelsesladet Obama ba om støtte til ny våpenlov
Moren til barna var hjemme da ulykken skjedde.
Hendelsen er den siste i en lang rekke tragiske hendelser som har ført til fornyet debatt om amerikanske våpenlover.
Meningsmålinger i USA viser at et flertall i befolkningen støtter et forbud mot såkalte angrepsvåpen og andre innstramminger.
Men lobbygruppene kjemper imot, og Obama har store problemer med å overtale et flertall i Kongressen om å støtte reformene av våpenlovene.
Les også: Flere vil ha strengere våpenlover
